GM - M3

Módulo 3. Técnicas de análisis de ácidos nucleicos de interés experimental y clínico. Análisis
molecular de la variabilidad genética y de relaciones entre individuos.

TÉCNICAS MOLECULARES BÁSICAS UTILIZADAS EN DIAGNÓSTICO

1. Southern y Northern Blots

      Dado que el gel de agarosa (empleado en electroforesis para separar y analizar ácidos nucleicos en función de su tamaño) es muy frágil, determinados análisis no se pueden realizar sobre el gel en sí mismo. Para ello, es necesario transferir e inmovilizar en membranas de nitrocelulosa o nylon los ácidos nucleicos previamente separados por electroforesis. La técnica de transferencia de ácidos nucleicos es el Southern blotting; la transferencia de ARN, Northern blotting, y la de proteínas, Western blotting.  
      La transferencia se realiza por capilaridad (ver imagen para seguir la explicación). Una vez separado el ADN o ARN mediante electroforesis en gel de agarosa, el gel se sitúa sobre una bandeja de vidrio en la que hay un trozo de papel de filtro por el que asciende el tampón de electroforesis. Sobre el gel se coloca la membrana y sobre ella varias capas de papel absorbente que hace ascender el tampón de transferencia. Éste atraviesa el gel y arrastra el ADN o ARN hasta la membrana donde es retenido. Los ácidos nucleicos deben unirse covalentemente a las membranas antes de detectar el gen de interés. Para ello se irradian las membranas con luz UV , que induce entrecruzamientos covalentes entre los nucleótidos y la membrana. Las moléculas transferidas pueden ser hibridadas con una sonda para demostrar la presencia de un gen o ARNm determinado.

Las aplicaciones son diferentes según el tipo de molécula a transferir: 

      - Southern Blot: estudio de la estructura de los genes y detección de mutaciones (inserciones, deleciones...)

      - Northern Blot: estudiar los patrones de expresión de genes (desarrollo embrionario, tejidos...)., tamaño y abundancia relativa del ARNm. Ej: transferencia de ARN de muchos tejidos; se inmoviliza en la membrana de nylon y se investiga la presencia de un ARNm determinado mediante hibridación con una sonda específica del gen de interés (ésta es ADN codificante del gen).

2 - Determinación de la secuencia de ácidos nucleicos
      La información básica sobre la estructura y la función biológica está codificada en la secuencia de ADN, vital para el conocimiento de la presencia mutaciones. El primer paso para secuenciar es la obtención de fragmentos de ADN apropiados. Hay dos maneras: mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o mediante endonucleasas. Los cromosomas son enormes y no pueden ser secuenciados del tirón, por lo que se hace preciso fragmentarlos. En ésta se utilizan distintas enzimas de restricción,  que permiten obtener fragmentos definidos de ADN que clonaremos gracias a la tecnología del ADN recombinante y posteriormente se aislarán por electroforesis en gel de agarosa.
      Ninguno de los métodos de secuenciación permite secuenciar más que unos pocos de cientos de nucleótidos de una sola vez. El método más sencillo y utilizado se sirve sólamente de reacciones sencillas y electroforesis en gel: el método de Sanger, secuenciación con didesoxinucleótidos ó método enzimático. Se basa en la síntesis enzimática de una serie de moléculas hijas incompletas (fragmentos) derivadas de la molécula de ADN a secuenciar. Estos fragmentos poseen un origen 5`común y terminaciones 3´ diferentes en bases específicas (estas últimas nos darán la información de la secuencia). Las terminaciones 3` se crean mediante una interrupción específica de la síntesis enzimática in vitro en una base determinada, mediante la incorporación de análogos de bases, los didesoxinucleótidos, que no permiten la continuación de la síntesis (terminadores de cadena). Se realizan cuatro reacciones, cada una de ellas en presencia de un didesoxinucleótido (de A,T, G ó C), cebadores (oligonucleótidos) y ADN polimerasa. Obtendremos de cada reacción muchos fragmentos acabados en A, T, G ó C, según la polimerasa haya encontrado en la cadena molde una T, A, C ó G, respectivamente. Al juntar los productos de las cuatro reacciones, tendremos una serie de fragmentos que difieren en un único nucleótido. Se analizan mediante electroforesis en gel de poro ínfimo (que sea capaz de separar n, n + 1 nucleótido), se autorradiografía y analiza el patrón de bandas. La tecnología ha permitido incluir un fluoróforo distinto a cada uno de los didesoxinucleótidos. Con un rayo láser se excitan y dan fluorescencia, lo que permite que un ordenador los detecte, determine su naturaleza dependiendo del fluoróforo que porten y los ordene para darnos la secuencia (hasta 1000 residuos de una).